NAT COMMUN:全外显子组测序发现斑秃存在KRT82基因的罕见变异|医学DNA专题

Original 运营部-ZDD 联川生物 2024-03-27

论文标题：Whole exome sequencing in Alopecia Areata identifies rare variants in KRT82

刊登日期：2022年01月

影响因子：17.694

主要技术手段：全外显子组测序

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背景

斑秃 (Alopecia areata, AA) 是自身免疫性疾病之一，以T细胞介导的毛囊免疫攻击导致脱发。早期的全基因组关联研究(GWAS)和Meta分析确定了14个遗传风险位点的共同变异，证实了这些变异位点在该疾病中的作用，但是由于区域较广，导致斑秃的强相关的罕见变异仍未发现。为了进一步评估与斑秃相关的未知基因中的罕见破坏性变异，研究人员使用全外显子组测序方法对 849 名斑秃患者和 15,640 名对照者进行了比较研究。

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结果

2.1 KRT82是斑秃风险基因

KRT82编码一种 II 型毛发特异性角蛋白，在毛干的角质层中具有独特的表达，在毛发结构中起重要作用。作者分析了KRT82基因中与斑秃相关的 11 种罕见、破坏性变异位点的位置（表 2），发现11 个KRT82变异位点中有9个与角蛋白疾病相关。三个KRT82变体位于 KRT82 的头部域（Ser16fs、Arg47X、Ile92Val），一个位于coil 1A（Asn129Lys）中，三个位于coil 2B 中（Arg314Gln、Arg314Trp、Glu351Lys），两个位于 KRT82 的Type II Tail中（Gly436Arg、Gly436Trp ）（图 2a，b )。这些明确定义的疾病相关区域中的错义和 LOF 变异有可能损害正常的中间纤维组装并破坏毛干角质层中角蛋白的完整性。另外，所有已鉴定的破坏性变异位点都属于远缘物种的进化保守残基，进一步支持了这些氨基酸在 KRT82 生物学中的重要性（图 2c）。因此，KRT82的功能性疾病域和进化上保守的氨基酸中的变异表明KRT82 的变异对蛋白功能可能造成了有害的影响，进而引起疾病发生。

图 2 KRT82变异定位于高度保守的疾病注释域

2.2 KRT82变异导致斑秃病理学证据

通过临床验证、活检免疫组织化学 (IHC) 和炎症性 ALADIN 基因表达特征对病例进行了准确的诊断（图 3a-c）。在四名具有KRT82错义变异的斑秃患者中，头皮样本的 IHC 显示 CD8+ 淋巴细胞的滤泡间浸润（图 3b）。ALADIN（斑秃疾病严重程度指数）指数利用角蛋白的表达谱和炎症基因特征来区分斑秃患者与对照。来自三名具有KRT82变体的患者的基因表达数据证实了炎症性 ALADIN 特征的增加，患者聚集在斑秃队列中并且远离对照组（图 3c）。

图 3：斑秃患者存在KRT82 变异

2.3 KRT82罕见突变导致斑秃

角蛋白基因家族内密切的共定位和结构相似性。研究人员对KRT82中的变异是否由于染色体区域或角蛋白家族基因的超突变性进行了分析。通过比较位于 KRT82 近端和远端的7个其他角蛋白基因(KRT5, KRT84, KRT85, KRT32, KRT35, KRT39, KRT40)的变异频率（图 4，表 3），发现其他的角蛋白基因中比KRT82 具有明显更少的变异。推断相关风险是由KRT82变异特异驱动的，而不是角蛋白基因家族或 12 号染色体块的广泛超突变性的结果。

图 4：II 型角蛋白基因在 Ch12 上聚集在一起。

作者对序列数据进行了单倍型分析，发现最常见的KRT82突变R47X 存在于至少六种不同的单倍型上，表明存在高频热点突变（图 5a）。KRT82 中的 R47X 突变类型是由甲基化 CpG 残基处的 C > T 转变引起的（图5b），5'-CGA-3' 编码精氨酸 (Arg; R)，当 5'-甲基胞嘧啶（C）脱氨基为胸腺嘧啶 (T) 时，这会导致无义突变。因此，推测斑秃患者中最常见的 KRT82 变异 R47X (15/849; 1.77%) 是由甲基化 CpG 位点的自发脱氨基作用引起的热点突变。

图 5：单倍型分析将 Arg47X 鉴定为热点突变。

2.4KRT82基因仅在毛囊生长期表达

为了进一步确定KRT82在毛囊中的功能，作者对KRT82 在整个斑秃模型小鼠毛囊周期（生长期、退行期和休止期）中的时空表达进行了研究。发现 KRT82仅在生长期于毛囊角质层中表达（图6），且在退行期和休止期中不表达。同时，自身免疫攻击仅在生长期发生，这就导致毛囊过早进入退行期，说明KRT82的表达特性与斑秃具有生物学相关性。

图 6：KRT82 仅在生长期中表达。

2.5斑秃患者中KRT82基因的表达水平降低

研究人员使用免疫荧光 (IF) 染色，发现 KRT82 在生长期毛干角质层表达，斑秃患者毛囊毛干角质层中较对照样本 KRT82 的表达显着降低（图 7a），而在健康成人指甲的任何成分中均未表达。研究人员发现不仅斑秃患者的 KRT82 表达显著降低，而且 KRT82下调也与疾病严重程度显着相关（图 7b），说明毛干角质层中KRT82的缺失低可能使遗传易感个体易患斑秃介导的脱发。

在 KRT82变异的患者皮肤中KRT82倾向于表达水平降低（图 7c），推测可能是变异通过潜在地改变或截断 KRT82 蛋白结构对斑秃患者的头皮表达产生影响，导致皮肤中的功能下降。通过对三名患者的损伤头皮活检中的 KRT82 和 CD8 表达来推断KRT82变体在毛囊中的功能效应，发现来自两名具有错义KRT82变体（Asn129Lys，Gly436Trp）的患者毛囊角质层中杂合 KRT82 的表达减少或缺失（图 7d），同时患者的 CD8+ T 细胞滤泡浸润也增加。表明KRT82中罕见的破坏性变异导致蛋白质功能或表达降低，使斑秃患者易患毛囊角质层结构受损，易受自身免疫攻击。

图 7：功能性 KRT82 表达在 AA HF 和皮肤中降低。

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结论

研究人员使用 WES 和基因水平变异分析识别了功能相关的疾病基因KRT82。确定了11个罕见的破坏性变异，包括一个频繁的突变热点 (R47X)，并描述了突变对斑秃中 KRT82 表达和功能的影响。这项工作不仅阐明了一种新的自身免疫性疾病终末器官遗传易感性的机制，而且还为治疗斑秃患者提供了潜在的新治疗方法。